无血清培养指南

无血清培养指南

添加时间:2017-09-12 22:15:00

无血清培养

应用指南 - 细胞牧场无血清培养 VERO 细胞工艺实例

摘要:细胞的体外规模化培养是生产生物制品的一种高效方法。尽管现在大多数细胞养仍然使用含血清的培养基培养,但是由于血清内部成分作用不明晰、生产稳定性较差、血清杂质影响生物制品后期加工等诸多缺陷,无血清培养将逐步取而代之。本研究利用细胞牧场切向流灌注培养的特性,为贴壁细胞开发了一套全新的无血清培养工艺。该工艺在细胞牧场 封闭系统中不需要添加任何胰酶抑制剂等外源蛋白,通过无血清培养基的连续置换常规含血清培养基实现了vero 的无血清培养工艺。

关键词:细胞牧场,细胞工艺,无血清培养,贴壁细胞,vero 细胞,灌注培养

1材料和方法

1.1试剂与耗材

Vero细胞(华南农业大学),DMEM培养液(Gibco,11995500)、无血清培养基(gibco,VP-SFM11681-020)、胰酶(Gibco,12605-028),谷氨酰胺(gibco)、特级胎牛血清(四季青),PBS配置用试剂(国产),T75细胞瓶(某公司),细胞牧场CF01(本公司)。

1.2方法

1.2.1细胞接种

a.将40ml培养基(含有10%FBS的DMEM培养基)加入到补液瓶中,打开动力装置,使得培养基充满装置的管路系统和细胞牧场。

b.调节管路中的阀门 ,接入悬浮的vero细胞(终密度为3*104个/cm2共9个重复),调节阀门使得细胞在细胞牧场内循环(流速60ml/min),待其均匀分布。

c.静置贴壁:将整个细胞牧场CF01置于37℃、5% C02的培养箱中静置培养5h。

1.2.2灌注培养

调节管路中的阀门,开启蠕动泵,控制培养液流速2ml/min,对细胞牧场CFO1中已贴壁的细胞进行循环灌注培养。24h时随机取三个重复,经0.1%胰酶消化收获细胞,采用血球计数板进行细胞计数。

1.2.4培养基替换

灌注培养24h时,将剩余的6个重复随机分为实验组和对照组,每组3个重复。实验组每个重复均通过持续灌注(培养液灌注速率为10ml/min)120ml无血清培养基(含1%谷氨酰胺)替换细胞牧场中旧的培养基DMEM+10%FBS,对照组各重复按照同样的方式用120ml新鲜的培养基(DMEM+10%FBS)替换细胞牧场中旧的培养基。培养基替换完成后,各重复中的培养基均维持40ml不变,并继续以 2ml/min流速,对细胞牧场CFO1中的vero细胞循环灌注培养 。

1.2.4细胞收货

72h时将所有 重复经0.1%胰酶消化收获细胞,采用血球计数板进行细胞计数。

1.3 结果与讨论

通过72H时收获的细胞密度(见图1)可知经过无血清培养基替换常规含血清培养基,并未影响vero细胞正常的增值效率,本次实验中实验组和对照组无显著差异,二者细胞量均有显著的提升。本实验利用细胞牧场独特的贴壁细胞灌流培养条件,创造性的通过连续灌流置换含血清培养基实现无血清培养工艺,避免了血清 内部成分作用不明晰、生产稳定性较差、其内杂质影响生物制品后期加工等诸多缺陷,当然这种无血清培养基连续置换的模式是否能够将血清替换干净,需要做进一步的研究,本实验通过 OH-置换对其进行了模拟(见附件一),通过模拟实验可推测:在连续无血清培养基灌流替换含血清培养基时,当无血清培养基为含血清培养基的 2倍体积时,细胞牧场中血清残余量可控制到血清初始浓度的万分之一。

实验组和对照组细胞密度对比

无血清工艺图111

Fig.1.细胞牧场中vero细胞在无血清培养工艺实验组(EG)与常规血清培养工艺对照组(CG)72h时收获细胞密度的比较。

 


 

附件一、血清置换率模拟实验

本实验通过连续灌流ph=7.41的水溶液来置换细胞牧场中ph=12.69的NaOH溶液,实时记录置换所需的水量与其对应的PH值,通过氢氧根离子的浓度的变化来反映NaOH溶液的残余量,以实现无血清培养基置换含血清培养基血清残余量的模拟。当置换体积为NaOH溶液2倍时,氢氧根离子的浓度已经低于初始浓度的万分之一,通过模拟实验可推测:在连续无血清培养基灌流替换含血清培养基时,当无血清培养基为含血清培养基的2倍体积时,细胞牧场中血清残余量可控制到血清初始浓度的万分之一。

血清置换模拟

Fig.2.血清置换模拟,图中POH每升高1表示OH-浓度稀释10倍


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