细胞牧场培养指南

细胞牧场培养指南

添加时间:2017-09-07 23:50:00

摘要: 伴随细胞培养技术在规模和可靠性方面的长足发展,细胞培养所获得的生物制品被证明是安全有效的,细胞源生物制品得到了社会的认可。无论兽用还是人用的生物药物和生物疫苗,都开始选择细胞培养技术进行生产,尤其对那些分子量相对较大、结构较复杂或有复杂的糖基化修饰的蛋白质和病毒疫苗来说,细胞培养成为了首选的生产方式。

本实验通过 vero 3T3      A549 等贴壁细胞的培养,证明了“流动态的细胞工厂”—细胞牧场,通过灌注培养可以实现贴壁细胞的高效增殖,与传统的静态 T      型培养瓶相比,细胞具有更长的对数生长期和更大的细胞收获量,可将其用于贴壁细胞培养工艺开发和规模化生产。

关键词 :细胞牧场,细胞工艺,贴壁细胞, vero      细胞, 3T3 细胞, A549      细胞,灌注培养

1 材料和方法

1.1      试剂与耗材

Vero 细胞(华南农业大学), 3T3 细胞(广州洁特生物过滤制品有限公司), A549      细胞(广东普奥思生物科技有限公司), DMEM  培养液( Gibco      )、胰酶( Gibco  ),特级胎牛血清(四季青),结晶紫、甲醛、 PBS  配置用试剂(国产), T75  细胞瓶(某公司),细胞牧场 CF01      (本公司)。

1.2      方法

1.2.1 贴壁细胞扩增培养

DMEM 添加 10%FBS 作为贴壁细胞的培养基 ,      将细胞接种于 T75 方瓶中培养。待细胞汇合度达到 80%-90%      时进行传代。传代的具体操作为 :  将原有培养基弃去 ,      PBS  缓冲液清洗 2      , 再添加 0.25%  胰酶进行细胞消化 , 消化后细胞重悬于含血清的培养基中 ,      1:3  1:4      比例进行传代 ,  最后添加新鲜培养基 ,  继续在 37  ℃、 5% CO 2       的培养箱中培养。

1.2.2 细胞牧场      CF01 中细胞的培养

a. 培养液预灌满:将 40ml培养基(含有 10%FBSDMEM培养基)加入到补液瓶中,打开动力装置,使得培养基充满装置的管路系统和细胞牧场。

b.      细胞接种:调节管路中的阀门  ,接入悬浮的细胞液( vero密度为 4.2*10 3 /cm 2 16个重复、 3T3细胞 2.0*10 4 /cm 2 3个重复、 A549细胞 2.3*10 4 /cm 2 3个重复),调节阀门使得细胞在细胞牧场内循环(流速 60ml/min),待其分布均匀。

c. 静置贴壁:将整个细胞牧场 CF01置于 37℃、 5% CO 2 的培养箱中静置培养 5h

d. 持续的灌流培养 :调节管路中的阀门 ,开启蠕动泵,控制培养液流速 2ml/min,对细胞牧场 CFO1中已贴壁的细胞进行循环灌注培养。

1.2.3  常规 T75瓶中细胞的培养

按照常规 T瓶培养方式操作,细胞接种密度为 vero细胞 4.2*10 3 /cm 2 3T3细胞 2.0*10 4 /cm 2 A549细胞 2.3*10 4 /cm 2 ;培养基:含有 10%FBSDMEM12ml/瓶; vero细胞 15个重复、 3T3细胞 3个重复、 A549细胞 3个重复。

1.2.4  细胞收获与计数

Vero 每隔 24h 两组实验各取三个重复经 0.1%      胰酶消化收获细胞、采用血球计数板进行细胞计数并绘制生长曲线。

72h 3T3 细胞和 A549      细胞的所有组进行 0.1% 胰酶消化收获细胞、采用血球计数板进行细胞计数。

1.2.5 细胞染色

96h 时取 Vero细胞的细胞牧场组 1个重复,通过常规结晶紫染色法对细胞牧场 CF01中的细胞染色,观察细胞在细胞牧场中的分布。

1.3  结果与讨论

1.3.1 vero 细胞生长曲线

Fig.1. 显示,在以低密度      4.2*10 3 /cm 2 接种 vero后, 0-72h间段      CF01 中的      细胞生长速率  小于 T75      瓶中 细胞生长速率,这可能是由于灌注培养条件下,活性较差的细胞容易被流动的培养基冲刷脱落,随着 vero细胞对流动态培养条件的适应,在 72hCF01       中的  细胞生长速率加快逐渐超过 T75  瓶中  细胞增殖速率,并持续维持在较长的对数生长期。 Fig.2.同样表明 120hCF01       中的 vero   细胞量高于     T75  瓶中 细胞量,差异极显著。

1.3.2 3T3 细胞和 A549细胞 72小时细胞密度比较

3T3 细胞和 A549细胞以高密度(      3T3 细胞 2.0*10 4 /cm 2 A549细胞 2.3*10 3 /cm 2       接入 细胞牧场 CF01   T75细胞瓶培养。 Fig.3表明 72h3T3细胞在 CF01T75细胞瓶中的细胞量无差别。      Fig.4显示 72hA549细胞在细胞牧场  CF01      中的量显著高于 T75细胞瓶中的量。

1.3.3 vero 细胞在细胞牧场 CF01中细胞分布

通过显微镜观察细胞牧场 CF01T75瓶中的 vero细胞镜下形态,二者形态未发现明显差别(见 Fig.5)。通过结晶紫染色细胞牧场 CF01vero细胞分布,      Fig.6 表明 vero细胞在细胞牧场中 CF01中呈均一分布。

Vero 细胞生长曲线

VERO生长曲线

Fig.1.vero 细胞在 T1875px 2 细胞培养瓶和细胞牧场 CF01中的细胞生长曲线。

Vero 细胞平均密度

VERO

Fig.2.vero 细胞在 T1875px 2 细胞培养瓶和细胞牧场 CF01中, 120h细胞平均密度。

3T3 细胞平均密度

3T3

Fig.3.3T3 细胞在 T1875px 2 细胞培养瓶和细胞牧场 CF01中, 72h时细胞密度。

A549 平均密度

A549

Fig.4.A549 细胞在 T1875px 2 细胞培养瓶和细胞牧场 CF01中, 72h时细胞密度。

Vero 细胞显微镜照片

JET-C-48H.2

JET-C-48H.3

Fig.5.倒置显微镜,10*100放大,vero细胞形态

细胞在CF01中的分布

IMG_20161219_094322

 

Fig.6.经结晶紫染色后,观察vero细胞在细胞牧场CF01中分布